通過冰芯取樣表征藥物瓶中的冷凍過程

摘要

原料藥 (DS) 的冷凍是一項(xiàng)關(guān)鍵的單元操作，可能會(huì)影響產(chǎn)品質(zhì)量，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集和不可見顆粒的形成。冷凍濃縮已被確定為影響冷凍期間蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的關(guān)鍵參數(shù)，因此應(yīng)盡量減少。宏觀冷凍濃縮（以下僅稱為冷凍濃縮）主要受冷凍速率的影響，而冷凍速率又受獨(dú)立于產(chǎn)品的工藝參數(shù)的影響，例如 DS 容器、其大小和填充水平以及冷凍設(shè)備。（大規(guī)模）工藝特性研究對于理解和優(yōu)化冷凍工藝至關(guān)重要。然而，評估冷凍濃縮需要對冷凍塊進(jìn)行取樣，這通常是通過將冰塊切成碎片進(jìn)行后續(xù)分析來完成的。此外，這些研究對大量產(chǎn)品的需求是一個(gè)主要限制。在這項(xiàng)研究中，我們報(bào)告了一種簡單的方法的開發(fā)，該方法使用替代溶液在相關(guān)規(guī)模上對瓶中的冷凍 DS 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)表征。新型冰芯取樣技術(shù)確定中心的軸向冰芯可指示低溫濃縮，低溫濃縮通過滲透壓和組氨酸與聚山梨醇酯 80 (PS80) 的濃度來測量，而滲透壓則顯示是一種靈敏的讀數(shù)。最后，我們通過比較不同冷凍方案（-80°C vs -40°C）的低溫濃縮來舉例說明該方法研究 DS 瓶中低溫濃縮的適用性。冷凍過程中的延長應(yīng)激時(shí)間與 2 L DS 瓶軸向中心滲透壓量化的更高程度的低溫濃縮相關(guān)。

關(guān)鍵詞 低溫濃縮 · 藥物瓶 · 冷凍保存 · 大規(guī)模冷凍 · 工藝表征

介紹

在生物制藥制造中，原料藥(DS) 通常以批量方式冷凍，以提高儲(chǔ)存穩(wěn)定性并大程度延長保質(zhì)期。儲(chǔ)存的目標(biāo)冷凍溫度通常為 -20°C、-40°C 或 < -65°C，并且不同公司的冷凍/解凍 (F/T) 設(shè)備、規(guī)程和目標(biāo)溫度可接受范圍通常不同。冷凍 DS 可以長期穩(wěn)定 DS，降低生物負(fù)荷控制（因此為非無菌）DS 中任何潛在微生物生長的風(fēng)險(xiǎn)，并避免 DS 和藥物產(chǎn)品 (DP) 的累積穩(wěn)定性。此外，冷凍 DS 還可以將 DS 與 DP 制造分離，同時(shí)提高 DP 生產(chǎn)的靈活性。另一方面，生物 DS 的冷凍和隨后的解凍可能會(huì)引發(fā)物理不穩(wěn)定性，這可能會(huì)影響產(chǎn)品質(zhì)量，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集和顆粒。為了減少 F/T 相關(guān)壓力和對產(chǎn)品質(zhì)量的潛在影響，需要了解 F/T 操作，以充分設(shè)計(jì)和控制這些關(guān)鍵工藝步驟。

冷凍過程尤其會(huì)對產(chǎn)品穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響。已發(fā)現(xiàn)各種應(yīng)力條件可能會(huì)在冷凍過程中破壞蛋白質(zhì)制劑的穩(wěn)定性，包括冰/液界面處的表面誘導(dǎo)降解以及與冷凍濃縮（也稱為冷凍濃縮）相關(guān)的不同條件。微觀冷凍濃縮是指溶質(zhì)在冰晶之間微觀空間中的必然濃縮，而宏觀冷凍濃縮則描述了溶質(zhì)在宏觀層面（厘米級(jí)）上的運(yùn)輸。

宏觀冷凍濃縮發(fā)生在溶液冷凍過程中，此時(shí)溶質(zhì)被排除在不斷增長的冰之外并逐漸濃縮，導(dǎo)致在達(dá)到玻璃化轉(zhuǎn)變溫度 (Tg’) 之前達(dá)到最大冷凍濃度，即整個(gè)系統(tǒng)凝固。這種宏觀冷凍濃縮（下文中將簡稱為冷凍濃縮）可能通過不同的機(jī)制導(dǎo)致蛋白質(zhì)制劑不穩(wěn)定，包括輔料結(jié)晶可能導(dǎo)致 pH 值變化、離子強(qiáng)度增加以及緩沖劑與蛋白質(zhì)之間的特定比例變化。值得注意的是，導(dǎo)致蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的各種冷凍相關(guān)降解機(jī)制是配方和蛋白質(zhì)有的，通常無法相互區(qū)分。盡量減少冷凍濃縮，從而在冷凍期間和冷凍后實(shí)現(xiàn)更均勻（同質(zhì)）的濃度分布是可取的，這也被認(rèn)為有利于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。

最重要的是，冷凍濃縮受多個(gè)產(chǎn)品和配方獨(dú)立工藝參數(shù)的強(qiáng)烈影響，例如冷凍設(shè)備、容器類型、幾何形狀和填充水平。這是因?yàn)檫@些參數(shù)會(huì)影響冷凍速率和冷凍方向。因此，可以獨(dú)立于活性藥物成分 (API) 進(jìn)行表征冷凍濃縮的工藝特性研究，例如通過使用替代配方。建議在代表性配置和規(guī)模下進(jìn)行研究，即在 DS 瓶中。冷凍對產(chǎn)品質(zhì)量的影響，即研究產(chǎn)品相關(guān)參數(shù)，可以在模擬所需低溫濃縮的合適小規(guī)模模型中進(jìn)行，因?yàn)榇罅?DS材料的可用性通常是制造規(guī)模工藝特性研究的主要限制。

無論使用何種冷凍工藝和設(shè)備，都必須很好地表征該工藝，以便理想地使用不同的冷凍和解凍速率。與 DS 袋不同，由于缺乏市售的活性 F/T 系統(tǒng)，以及在擴(kuò)大規(guī)模過程中與幾何相關(guān)的工藝挑戰(zhàn)，DS 瓶中的控制冷凍尤其具有挑戰(zhàn)性。簡而言之，增加瓶子尺寸會(huì)導(dǎo)致表面與體積比降低，這會(huì)嚴(yán)重影響熱交換，減慢冷凍過程并可能增加冷凍濃縮。因此需要很好地了解不同規(guī)模的冷凍過程。

與 F/T 研究不同，在 F/T 研究中可以在冷凍和解凍后甚至在多次 F/T 循環(huán)后收集和分析液體樣品，而冷凍過程本身的表征需要對冰塊進(jìn)行取樣，以便分析冷凍狀態(tài)下的冷凍濃度。這些冷凍取樣程序通常費(fèi)力且耗時(shí)，需要特定工具將冰塊切成隨后可進(jìn)行分析的碎片。先前的研究通常使用帶鋸切割冰塊，而其中一些研究還報(bào)告了與這些程序相關(guān)的具體挑戰(zhàn) [31–33]，總體而言，此類研究通常僅包括少數(shù)實(shí)驗(yàn)條件和很少或沒有實(shí)驗(yàn)重復(fù)。

與之前專注于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的冷凍研究相比，我們開發(fā)了一種簡單、快速的方法來研究冷凍狀態(tài)下的低溫濃縮并評估與產(chǎn)品無關(guān)的工藝參數(shù)，例如冷凍設(shè)備、冷凍機(jī)類型、冷凍目標(biāo)溫度、容器類型、容器大小等。在本研究中，我們提出了一種新穎的采樣技術(shù)，通過冰芯鉆孔結(jié)合替代溶液的使用，可以表征 DS 瓶中的冷凍過程，從而確定進(jìn)一步研究的關(guān)鍵工藝參數(shù)。取樣從 DS 瓶的頂部進(jìn)行，并進(jìn)一步優(yōu)化，以通過僅取樣相關(guān)位置來減少取樣工作量。替代溶液中溶質(zhì)的低溫濃縮程度通過滲透壓、組氨酸和 PS80 含量來量化。為了舉例說明該方法，我們比較了在 -40°C 與 -80°C 靜態(tài)冷凍條件下 2 L DS 瓶中的低溫濃度，以證明區(qū)分不同冷凍方案的適用性。

材料和方法

樣品制備

制備了代表標(biāo)準(zhǔn)單克隆抗體 (mAb) 配方的替代溶液，該替代溶液包含 20 mM L-組氨酸緩沖液、240 mM 蔗糖、10 mM L-蛋氨酸和 0.04% 聚山梨醇酯 80 (PS80)，pH 值為 5.5（Tg’ -34°C，~ 1.3 cP）。L-組氨酸、L-組氨酸 HCl、L-蛋氨酸和 PS80（J.T. Baker）從 VWR（瑞士迪提康）購買，蔗糖從 Pfanstiehl（瑞士祖格）購買。使用從 VWR（瑞士迪提康）購買的 0.22 µm PVDF 過濾器對制備的替代溶液進(jìn)行無菌過濾。

將 2 L 替代溶液裝入 SaniSure（盧森堡巴沙拉日）提供的 2 L 聚碳酸酯 PharmaTainer™ 瓶中，并在 Thermo Fisher Scientific（美國北卡羅來納州阿什維爾）的 -80°C 超低溫 (ULT) 冰箱 Revco™ (RDE50086FV) 或 Snijders Labs（荷蘭蒂爾堡）的 -40°C 低溫冰箱 (VF360-45G) 中被動(dòng)冷凍。

在開始實(shí)驗(yàn)運(yùn)行之前，將單個(gè) DS 瓶放置在空冰箱底架的中央，并將門打開時(shí)間為 1 分鐘。

Ice Core Sampling 冰芯取樣

如圖 1 所示，使用冰芯鉆孔技術(shù)對冷凍取樣獲得的樣品進(jìn)行冷凍后溶液成分的低溫濃縮分析。

連續(xù)使用兩種不同的設(shè)置。第一種設(shè)置每瓶收集三個(gè)軸向冰芯（圖 1a）進(jìn)行橫截面分析。對于邊緣（E）和半徑向距離（H）冰芯位置的取樣，在冷凍前將瓶子的上部切掉并用膠帶緊緊封閉。優(yōu)化的設(shè)置（圖 1b）僅通過瓶口收集瓶子徑向中心的冰芯。頂部的第一個(gè)樣品總是用直徑為 21 毫米的不銹鋼手動(dòng)取芯器手動(dòng)取出，取樣深度約為 20 毫米，以標(biāo)記后續(xù)機(jī)器鉆孔的位置。

為了在冰芯中鉆孔，將瓶子緊緊固定在虎鉗中，并使用配備不銹鋼芯鉆（內(nèi)徑：16 毫米，外徑：21 毫米，長度：200 毫米）的電鉆機(jī)（SFS Group，瑞士 Heerbrugg）進(jìn)行鉆孔，該鉆機(jī)來自 Bürkle GmbH（德國巴特貝林根）。使用樣品彈出器附件將冰芯從空心芯鉆中輕輕取出，并放置在干凈的工作表面上，預(yù)先標(biāo)記好 25 毫米的部分（圖 1c）。將樣品分離并轉(zhuǎn)移到試管中進(jìn)行解凍，并從底部開始編號(hào)。由于冷凍后在冷凍塊中心存在冰山，因此收集的樣品數(shù)量從 11 到 13 不等。此外，由于瓶子中心的凹形，H 和 E 軸上的鉆孔深度略深。為了消除采樣程序（開放式處理）中潛在的外部顆粒污染，樣品解凍后用 5.0 µm PVDF MillexSV 注射器過濾器（Merck，瑞士 Buchs）進(jìn)行過濾，然后儲(chǔ)存在 -80°C 下直至分析。

溫度曲線

在一個(gè)案例研究中，應(yīng)用兩種不同的冷凍方案，即冷凍至 -80°C（RDE50086FV Revco™ ULT 冷凍機(jī)）或 -40°C（VF360-45G 低溫冷凍機(jī)），在冷凍過程中記錄了溫度曲線。

對于進(jìn)行冰芯鉆探的 DS 瓶，使用 Testo（瑞士門夏爾特多夫）的 Pt-100 溫度探頭記錄 DS 瓶外部的溫度（見圖 1b）。作為對照，使用相同的溫度映射設(shè)置記錄了單獨(dú)的對照瓶中的溫度曲線，但在液體中放置了額外的 Typ-T 熱電偶（來自 TC GmbH）（見圖 2），以便將對照瓶的溫度曲線與用于冰芯采樣的瓶子的溫度曲線進(jìn)行比較。通過比較可以將對照實(shí)驗(yàn)中估計(jì)的應(yīng)力時(shí)間轉(zhuǎn)移到用于冰芯鉆探的 DS 瓶中。對于控制溫度測量，將熱電偶放置在第一個(gè)凍結(jié)點(diǎn) (FPF) 和最后一個(gè)凍結(jié)點(diǎn) (LPF) 處，并使用相同的凍結(jié)方案進(jìn)行凍結(jié)。對于本研究中使用的配置（被動(dòng)凍結(jié)一個(gè)裝滿 2 L 的 2 L DS 瓶），F(xiàn)PF 和 LPF 分別位于邊緣底部和徑向中心，液位高度約為 1.5 L，如先前確定的。

分析溫度曲線，從兩個(gè)獨(dú)立的溫度映射實(shí)驗(yàn)中評估應(yīng)力時(shí)間的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，作為 FPF 處 < 0°C 到 LPF 處 -34°C 之間的時(shí)間跨度，即替代溶液的 Tg'。

圖 1 冷凍 DS 瓶中冰芯取樣技術(shù)和溫度監(jiān)測示意圖。a 橫截面分析：在不同徑向位置（瓶子的側(cè)面和頂視圖）取樣三個(gè)冰芯，即在中心 [C]、半徑向距離 [H] 和邊緣 [E]。b 中心芯分析：通過瓶口取樣中心芯。溫度探頭連接在瓶子外部，用于在冷凍期間記錄溫度。c 帶有冰芯樣品彈出器的冰芯鉆頭和彈出的冰芯，分成 25 毫米長的樣品

圖 2 DS 瓶內(nèi)的溫度測繪裝置示意圖，用于記錄第一個(gè)凍結(jié)點(diǎn) (FPF)、最后一個(gè)凍結(jié)點(diǎn) (LPF) 和瓶外的溫度

溫度數(shù)據(jù)由 OMEGA Engineering GmbH（德國 Deckenpfronn）的 RDXL6SDUSB 數(shù)據(jù)記錄器記錄，并使用 Origin Lab 軟件版本 2023（OriginLab Corporation，美國馬薩諸塞州北安普敦）進(jìn)行評估。

分析方法

滲透壓

滲透壓濃度通過凝固點(diǎn)降低測量，使用 Gonotec 的 Osmomat 3000 儀器，該儀器由 Haslab GmbH（瑞士比爾本肯）訂購。樣品在校準(zhǔn)范圍內(nèi)測量三次，范圍在 0 mOsmol/Kg 和 850 mOsmol/Kg 之間。如果需要進(jìn)行分析，樣品用水稀釋。

PS80 量化

PS80 通過 Brito & Vaz 描述的 HPLC-熒光膠束測定法進(jìn)行定量分析。簡而言之，根據(jù) Schmidt 等人的方法測量未稀釋的樣品。使用 Waters Acquity Arc Premier 系統(tǒng)（瑞士巴登）與 Waters 2475 熒光檢測器（瑞士巴登）耦合。使用 0.004% 至 0.1% 之間的校準(zhǔn)范圍，如果需要，用水稀釋樣品。

組氨酸定量

采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳 (CZE) 方法對組氨酸進(jìn)行定量分析，所用設(shè)備為 SCIEX PA800plus 系統(tǒng)（Brea；美國），該系統(tǒng)配備有紫外檢測器、214 nm 濾光片（SCIEX）、溫控自動(dòng)采樣器和 30 kV 電源。測量采用 Molex（Lisle；美國）的熔融石英毛細(xì)管進(jìn)行，其內(nèi)徑為 30 µm，長度為 20/30 cm。在一個(gè)序列中，樣品儲(chǔ)存在 10°C 的自動(dòng)采樣器中。對于分離緩沖液，使用 150 mM 磷酸鹽溶液（pH 1.5）與 5% IPA 混合。在注入樣品之前，用 1 M HCl、H2O 和背景電解質(zhì)沖洗毛細(xì)管，或每次在 50 psi 下沖洗三分鐘。通過三次標(biāo)準(zhǔn) CZE 運(yùn)行和一個(gè)空白，使新鮮的毛細(xì)管平衡以適應(yīng)分離緩沖液條件。分離電壓設(shè)定為 +28 kV。使用的校準(zhǔn)范圍為 1 至 100 mM 組氨酸，并向每個(gè)樣品中添加 20 mM 4-氨基苯甲酸作為內(nèi)標(biāo)。

數(shù)據(jù)評估

低溫濃縮分析結(jié)果以濃度因子表示，其計(jì)算方法是將樣品濃度除以替代溶液的初始濃度。使用 OriginPro 2023 版（OriginLab Corporation，美國馬薩諸塞州北安普頓）對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。

結(jié)果與討論

DS 瓶中的低溫濃度分布圖

建立了冰芯取樣方法，以研究裝有 2 L 替代溶液的 2 L DS 瓶中的低溫濃縮，該替代溶液代表 mAb 配方。在第一個(gè)設(shè)置中（圖 1a），在從三個(gè)軸向冰芯收集的樣品中確定了在 -80°C 下冷凍后 2 L 瓶中溶質(zhì)的分布。滲透壓（圖 3a）被測量為一個(gè)依數(shù)參數(shù)，代表替代溶液中的組氨酸和蔗糖濃度；組氨酸（圖 3b）被量化為緩沖系統(tǒng)和可能的 pH 平衡的變化指標(biāo)，PS80（圖 3c）被量化為生物制劑配方中穩(wěn)定界面應(yīng)力的關(guān)鍵賦形劑。對于所有三個(gè)測試的配方參數(shù)，冷凍本體中的溶質(zhì)分布闡明了朝向冰丘底部中心和頂部的鐘形濃度分布。

之前在不同研究中觀察到了溶質(zhì)的鐘形濃度，這些研究采用了類似的條件但不同的采樣技術(shù) 。例如，將 mAb 制劑在圓形 1 L HDPE 瓶中冷凍至 -70°C（通過滲透壓和 mAb 濃度量化）后，其濃度呈鐘形。同樣，對于不同的冷凍方案，Kolhe 及其同事報(bào)告了瓶中冷凍的鐘形濃度曲線，而冷凍至 -40°C 和 -20°C 產(chǎn)生的冷凍濃縮程度高于冷凍至 -70°C 的瓶子。Duarte 等人 使用了與本研究中介紹的類似的裝置。他們將裝滿牛血清白蛋白 (BSA) 溶液的 2 L 矩形 DS 瓶冷凍至 -75°C，但使用了帶有強(qiáng)制空氣對流的干冰室。作者報(bào)告稱，與本文中提出的替代溶液的結(jié)果相比，2 L 瓶內(nèi)的 BSA 分布情況相當(dāng)，并且還發(fā)現(xiàn)，與前面提到的 Kolhe & Badkar 的研究相反，頂部存在高度濃縮的區(qū)域 。Padala 等人在 -30°C 的步入式冷凍柜中冷凍 10 L 玻璃瓶中的 8.5 kg BSA 溶液后，分析了 BSA 的低溫濃縮情況，甚至發(fā)現(xiàn)頂部的濃度最高。

圖 3 a-c 在 -80°C 冰箱中被動(dòng)冷凍后，2 L DS 瓶中 2 L 替代溶液的中心核心采樣的代表性橫截面輪廓圖和 d-f 條形圖。數(shù)字表示 a、d 滲透壓、b、e PS80 和 c、f 組氨酸的濃度因子。輪廓圖和條形圖使用相同的顏色標(biāo)度進(jìn)行視覺比較。對于 d-f，數(shù)據(jù)表示為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差

在停滯空氣條件下（標(biāo)準(zhǔn) ULT 冷凍機(jī)），瓶內(nèi)被動(dòng)冷凍預(yù)計(jì)會(huì)以從外到內(nèi)的徑向冷凍幾何形狀發(fā)生，這與冰丘的形成有關(guān)。這些冰丘是由于冷凍過程中體積膨脹而形成的，這導(dǎo)致因徑向冷凍而滯留在中心的濃縮液體被向上推到頂部。

除了不在本研究范圍內(nèi)的配方相關(guān)參數(shù)（例如粘度、Tg’）外，已知與工藝相關(guān)的參數(shù)（例如冷卻速率、熱流方向、容器幾何形狀和填充水平）對冷凍后溶質(zhì)的分布曲線有重大影響。事實(shí)上，這些參數(shù)影響溶質(zhì)的對流質(zhì)量流與被滯留在不斷增長的冰中的溶質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的相互作用，這最終決定了冷凍塊中溶質(zhì)的分布。例如，凍結(jié)鋒速度首先影響冰鋒的形態(tài)，而冰鋒的形態(tài)決定了被困在冰中的溶質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；其次，溶質(zhì)離開冰鋒的運(yùn)動(dòng)由液相中的擴(kuò)散和對流決定。因此，快速凍結(jié)被描述為減弱冷凍濃縮的程度。

總之，鐘形低溫濃度分布被認(rèn)為是 DS 瓶中典型的徑向和慢速冷凍幾何形狀的結(jié)果。僅部分被困在徑向生長的冰中的溶質(zhì)被連續(xù)輸送到中心，而未凍結(jié)液體中的密度梯度（由溫度梯度引起）促進(jìn)自然對流，將溶質(zhì)向下拖拽的速度高于沿徑向中心向上輸送的速度 。容器幾何形狀和熱流方向決定了形成的冰幾何形狀，從而決定了尚未凝固的液體的剩余空間，溶質(zhì)在其中發(fā)生對流運(yùn)動(dòng)。由于被動(dòng)冷凍 DS 瓶中溶質(zhì)的分布分布是徑向冷凍幾何形狀的結(jié)果，因此高濃度區(qū)域預(yù)計(jì)沿垂直軸。

因此，我們選擇瓶子中的軸心作為分析低溫濃度和優(yōu)化冰芯鉆探裝置 1 的代表區(qū)域（圖 1a）。優(yōu)化設(shè)置 2（圖 1b）僅從軸心芯收集樣本，其中包括最后凝固的代表性中心區(qū)域。在優(yōu)化設(shè)置中，冰芯通過瓶口取樣，如圖 1b 所示，無需切掉瓶子的頂部。

與僅分析中心芯的優(yōu)化設(shè)置（圖 3d-f）相比，橫截面分析報(bào)告的溶質(zhì)濃度（圖 3a-c）產(chǎn)生了類似的結(jié)果。橫截面分析中的最高濃度位于最底部的中心（位置 1 圖 3d-f），而對于優(yōu)化設(shè)置（中心芯分析），最高溶質(zhì)濃度可重復(fù)地發(fā)現(xiàn)略高于底部（位置 2 圖 3d-f）。在冷凍過程中，橫截面分析中瓶子的頂部被切掉并用膠帶固定，這意味著瓶子在設(shè)置 1 中不是氣密的/壓力密封的。與最終優(yōu)化設(shè)置中未經(jīng)操作的瓶子相比，瓶子的操作可能解釋了橫截面分析中最高溶質(zhì)濃度位置的輕微變化。與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)一致，我們的研究結(jié)果證實(shí)，瓶子中冷凍塊體徑向軸的中心核既反映了濃度熱點(diǎn)（即頂部和底部附近的最大冷凍濃度），也覆蓋了低濃度區(qū)域，例如頂部高濃度部分的下方。

已證明與冷凍過程相關(guān)的不穩(wěn)定性是冷凍濃縮產(chǎn)生不均勻冷凍基質(zhì)的結(jié)果。在濃度較低的區(qū)域、賦形劑和蛋白質(zhì)之間比例發(fā)生變化的區(qū)域以及頂部的冰丘區(qū)域 都觀察到了降解。與直覺相反，這意味著蛋白質(zhì)降解通常不會(huì)發(fā)生在冷凍塊中冷凍濃度最高的區(qū)域。

因此，中心核心被認(rèn)為是預(yù)測 DS 瓶中冷凍濃縮發(fā)生的指示性指標(biāo)，因?yàn)樗从沉死鋬鰸饪s的程度，覆蓋了瓶中低濃度和高濃度區(qū)域之間的廣泛范圍。然而，對于使用截然不同的冷凍工藝（例如，可能對瓶中的冷凍幾何形狀產(chǎn)生影響，如氣流冷凍機(jī)的情況）的瓶子，建議對瓶子進(jìn)行擴(kuò)展分析，以確認(rèn)中心軸仍然反映瓶子內(nèi)相關(guān)的感興趣區(qū)域。值得注意的是，通過瓶子開口取樣的中心核心的優(yōu)化設(shè)置不需要操縱瓶子，并且大大降低了取樣程序的復(fù)雜性和時(shí)間。

不同溶液成分的低溫濃縮

為了研究冷凍濃縮，我們分析了滲透壓并量化了替代溶液樣品的 PS80 和組氨酸濃度，并將結(jié)果報(bào)告為濃縮因子。對于兩種采樣裝置的三個(gè)讀數(shù)，確定了相似的濃縮因子，如圖 3a-c 和 d-f 所示。定量地看，滲透壓和組氨酸的趨勢產(chǎn)生了可比的濃縮因子，與 PS80 的濃縮因子相比略高。根據(jù)替代溶液的成分，滲透壓主要反映溶液中的組氨酸和蔗糖濃度。

有趣的是，文獻(xiàn)中的幾項(xiàng)研究報(bào)告稱，配方輔料（例如糖和緩沖鹽）的濃縮程度通常比蛋白質(zhì)更高，這主要?dú)w因于這些分子的不同擴(kuò)散系數(shù)。在 Bluemel 等人的研究中，在含有 PS80 的組氨酸緩沖液中配制的 mAb 在 2 L 瓶中冷凍至 -40°C。對冷凍塊中低溫濃縮的分析表明，與溶液中的 mAb 和 PS80 相比，組氨酸的濃縮程度更高。濃縮程度確實(shí)與這三種成分的測量擴(kuò)散系數(shù)相關(guān)。有趣的是，mAb 和 PS80 的濃縮程度相似，這可以通過 PS80 膠束和 mAb 分子的擴(kuò)散系數(shù)相似來解釋。然而，不能排除 PS80 作為一種傾向于與表面（冰/液體表面）相互作用的表面活性分子，其行為可能與其他小分子成分不同，但更相似，就像蛋白質(zhì)也是兩親分子一樣。

其他作者描述說，對流驅(qū)動(dòng)的溶質(zhì)運(yùn)動(dòng)主導(dǎo)了擴(kuò)散的影響，因此得出結(jié)論，化合物擴(kuò)散系數(shù)的差異可以忽略不計(jì)。

Weber 和 Hubbuch 通過時(shí)間分辨在線拉曼光譜從機(jī)制上研究了溶液中不同成分的低溫濃縮過程。簡而言之，凍結(jié)前沿剩余液相中溶質(zhì)的質(zhì)量傳輸是分子對流和擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)之間復(fù)雜相互作用的基礎(chǔ)，這種相互作用受上述過程相關(guān)參數(shù)的影響，也受決定分子流動(dòng)性的溶液特性（如其特定的擴(kuò)散系數(shù)和粘度）的影響。

因此，可以假設(shè)溶液中的小分子濃縮到更高的程度，這與本研究通過單獨(dú)觀察組氨酸濃度或通過滲透壓作為組氨酸和蔗糖的累積參數(shù)觀察到的結(jié)果一致。因此，我們將滲透壓視為一種靈敏的讀數(shù)，以研究 DS 瓶中的冷凍濃縮與冷凍過程的關(guān)系。

增加粘度可以通過限制溶液內(nèi)的自然對流和擴(kuò)散來抵消冷凍濃縮的影響，這種影響甚至在冷卻時(shí)會(huì)加劇，正如 Bluemel 等人所展示的那樣。我們還可以使用我們的裝置研究粘度對最終冷凍濃縮的影響。本研究中使用的替代溶液具有相對較低的粘度，代表了一種靈敏的裝置，經(jīng)過優(yōu)化可研究工藝參數(shù)。

總之，盡管 PS80 的冷凍濃縮可能對蛋白質(zhì)分子具代表性，但為了研究冷凍濃度與冷凍過程參數(shù)的關(guān)系，滲透壓（在我們的配方中主要代表組氨酸和蔗糖）是靈敏的讀數(shù)，同時(shí)與單個(gè)成分的含量分析相比，它是一種快速而簡單的分析方法。

案例分析

我們采用優(yōu)化的冷凍取樣方法研究了不同冷凍方案（即不同的目標(biāo)冷凍溫度 -40°C 和 -80°C）下 2 L DS 瓶中替代溶液的冷凍濃縮。

我們使用傳統(tǒng)的 -40°C 冷凍機(jī)故意誘導(dǎo)更長的應(yīng)力時(shí)間，而 -80°C 冷凍由于溫差較低而延長了達(dá)到 Tg' 以下溫度的時(shí)間跨度。應(yīng)力時(shí)間是從冰核開始到達(dá)到 Tg'（冷凍基質(zhì)凝固）的時(shí)間跨度。在此時(shí)間跨度內(nèi)，液相中的溶質(zhì)不斷濃縮，因此應(yīng)力時(shí)間可視為冷凍過程中冷凍濃縮的指標(biāo)。

我們根據(jù)圖 2 所示的設(shè)置通過溫度映射表征了兩種冷凍方案，并確定了在 -80°C 和 -40°C 下冷凍的應(yīng)力時(shí)間分別為 4.9 小時(shí)（± 0.2）和 11.2 小時(shí)（± 0.2）。圖 4 顯示了采樣瓶（經(jīng)過冰芯采樣）外部記錄的代表性溫度曲線和相應(yīng)溫度。采樣瓶外部記錄的溫度曲線與溫度映射實(shí)驗(yàn)的相應(yīng)曲線相匹配，證明了冷凍程序的可重復(fù)性，從而證明了用于估計(jì)實(shí)際采樣瓶中應(yīng)力時(shí)間的溫度數(shù)據(jù)的有效性。

冷凍濃度通過滲透壓定量（圖 5）。在 -40°C 下冷凍與在 -80°C 下冷凍相比，產(chǎn)生的濃度曲線不同。在 -40°C 下冷凍的瓶子承受的壓力時(shí)間是其 2 倍多，導(dǎo)致冷凍濃縮程度更高，而且濃縮的底部區(qū)域沿著中心核心分布在更寬的區(qū)域。因此，我們確認(rèn)冷凍替代溶液的中心核心采樣方法結(jié)合滲透壓讀數(shù)是一種靈敏的方法，可以表征和區(qū)分冷凍方案并研究 2 L DS 瓶中的冷凍濃度。

圖 4 在 a -80°C 冰箱和 b -40°C 冰箱中，2 L DS 瓶中 2 L 替代溶液被動(dòng)冷凍的代表性溫度曲線。記錄了進(jìn)行冰芯采樣的瓶子的溫度曲線（紫線），并將其與對照實(shí)驗(yàn)記錄的溫度曲線疊加。在相同條件和冷凍方案下冷凍的對照瓶的溫度曲線記錄在瓶子外部（紅線），以及第一個(gè)冷凍點(diǎn) (FPF)（紅色虛線）和最后一個(gè)冷凍點(diǎn) (LPF)（紅色虛線）

圖 5 在 -40°C 冰箱中被動(dòng)冷凍后，在 2 L DS 瓶中的 2 L 替代溶液的中心核心中分析的低溫濃縮，顯示為滲透壓的濃度因子

應(yīng)用和限制

在本研究中，我們報(bào)告了一種便捷方法的開發(fā)，該方法使用替代溶液在相關(guān)規(guī)模上對 DS 瓶中的冷凍過程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)表征。將所提出的方法與以前報(bào)告的采樣技術(shù)進(jìn)行比較，幾乎所有的冷凍研究都采用冷凍采樣，即使用帶鋸將冷凍塊切成小方塊。這些程序通常需要首先將容器與冷凍塊分離，然后沿三維軸逐片切割冷凍塊或從預(yù)切切片中取出核心樣本，最終獲得大小相同的樣品塊。在實(shí)踐中，這個(gè)過程很費(fèi)力，因此很耗時(shí)，并且需要特定的設(shè)備和設(shè)施。此外，以前報(bào)告的程序仍然存在一些挑戰(zhàn)，例如需要預(yù)冷鋸片或在切割前將樣品存放在干冰上。此外，根據(jù)容器的表面材料，報(bào)告稱冷凍塊與容器的緊密粘附，這需要例如加熱接觸面以將冰從容器壁上分離。

然而，所有冷凍采樣技術(shù)，包括我們的巖心鉆探技術(shù)，都需要開放式處理，存在樣品受到外部污染（例如顆粒污染）的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)所采用的溶液（替代物或蛋白質(zhì)溶液）和分析方法，應(yīng)采用適當(dāng)?shù)臉悠分苽浞椒?。然而，像本研究中?bào)告的技術(shù)一樣，采用更少的處理步驟并且對 DS 容器本身無損的采樣技術(shù)最終將減少來自環(huán)境和過程的潛在顆粒污染。

盡管通常沒有明確提及，但采樣程序本身被認(rèn)為對結(jié)果有重大影響，特別是對冷凍濃縮的程度，通常報(bào)告為與初始濃度相比的濃度因子。通過冷凍采樣確定冷凍濃度在很大程度上取決于采樣冰塊的大小，正如之前提到的。值得注意的是，冷凍采樣方法總是描述宏觀的，而不是微觀的冷凍濃縮，因此從冷凍塊中收集的樣品的大小/體積肯定決定了樣品的稀釋程度。例如，在高濃度區(qū)域收集的較小尺寸的樣品會(huì)產(chǎn)生更高的最大濃度，這在概念上可以描述為方法的“分辨率"。在數(shù)據(jù)解釋和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，應(yīng)考慮這種不可避免的樣本量依賴性限制。這意味著，使用不同采樣設(shè)置和配置的不同研究的結(jié)果不能直接相互比較，并且采樣技術(shù)從冷凍批量中收集相同大小的樣品的能力至關(guān)重要，即使樣本大小的某些變化是不可避免的，例如由于冰結(jié)構(gòu)和成分的變化。本研究開發(fā)的技術(shù)通過仔細(xì)選擇鉆井設(shè)備的尺寸并隨后分離冷凍樣品，有助于生成小樣本。

由于冷凍過程主要由與產(chǎn)品無關(guān)的工藝參數(shù)決定，例如如上所述的容器幾何形狀、尺寸和填充量，因此使用替代品（代替高價(jià)值的蛋白質(zhì)溶液）進(jìn)行工藝表征研究能夠表征冷凍過程，并允許在相關(guān)的代表性配置和規(guī)模（即在 DS 瓶中）下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)表征。使用替代溶液可以進(jìn)行大量獨(dú)立于產(chǎn)品的實(shí)驗(yàn)和各種工藝參數(shù)的測試，從而能夠篩選和識(shí)別關(guān)鍵工藝參數(shù)。根據(jù)冷凍研究的目的，可以優(yōu)化替代溶液的性質(zhì)，使其與特定產(chǎn)品的性質(zhì)相匹配，或與典型的 DS 溶液的性質(zhì)相匹配。在我們的研究中，我們選擇了一種具有典型配方成分的替代溶液，該替代溶液具有與冷凍濃縮相關(guān)的但最壞情況的性質(zhì)（低粘度和低 Tg'），以生成一個(gè)靈敏的設(shè)置來量化冷凍濃縮。對于以工藝參數(shù)為重點(diǎn)的工藝表征，滲透壓是一種簡單而有代表性的讀數(shù)，用于指示替代溶液的冷凍濃縮的發(fā)生。

由于 DS 材料的可用性通常是制造規(guī)模工藝表征研究的主要限制，因此可以在合適的小規(guī)模模型中研究冷凍對產(chǎn)品質(zhì)量的影響，這些模型模擬預(yù)期濃度，例如在使用替代溶液進(jìn)行相關(guān)規(guī)模的補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)中確定的濃度。因此，了解冷凍過程和過程參數(shù)的相關(guān)性也使得選擇有意義且相關(guān)的條件進(jìn)行小規(guī)模產(chǎn)品質(zhì)量測試成為可能。

結(jié)論

冷凍和解凍是生物分子制造過程中的關(guān)鍵單元操作，必須對其進(jìn)行充分表征以盡量減少其對產(chǎn)品質(zhì)量的影響。

特別是冷凍過程可能會(huì)在整個(gè)冷凍 DS 中產(chǎn)生相當(dāng)大的不均勻性，這與許多不利條件有關(guān)，例如賦形劑和蛋白質(zhì)濃度的變化、與自身相互作用傾向的潛在變化相關(guān)的離子強(qiáng)度變化或 pH 值的變化，這可能會(huì)影響聚集體形成和顆粒物等關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

為了研究 DS 瓶中的低溫濃縮，我們報(bào)告了一種簡單的采樣方法，通過冰芯鉆孔使用滲透壓作為一種快速靈敏的讀數(shù)，而不是以前耗時(shí)且復(fù)雜的冷凍采樣技術(shù)。我們的方法特別適合表征與產(chǎn)品無關(guān)的工藝參數(shù)，例如比較冷凍設(shè)備或冷凍方案，如案例研究中所示。使用替代溶液可以在足夠高的分辨率下篩選制造規(guī)模的多個(gè)工藝參數(shù)，以便識(shí)別關(guān)鍵工藝參數(shù)，而無需大量蛋白質(zhì)溶液。

縮寫 API：活性藥物成分；BSA：牛血清白蛋白；C：中心；CZE：毛細(xì)管區(qū)帶電泳；DS：藥物物質(zhì)；DP：藥物產(chǎn)品；E：邊緣；FPF：第一個(gè)冷凍點(diǎn)；F/T：冷凍/解凍；H：半徑向距離；LPF：最后一個(gè)冷凍點(diǎn)；mAb：單克隆抗體；PS80：聚山梨醇酯 80；Tg：玻璃化轉(zhuǎn)變溫度；ULT：超低溫